Larry Daley (Ben Stiller) deixou o posto de guarda noturno há dois anos, abrindo sua própria empresa. De vez em quando ele volta ao Museu de História Natural, onde trabalhava, para rever os amigos que, à noite, ganham vida. Só que o museu está prestes a passar por uma reforma visando sua modernização, o que fará com que vários dos bonecos de cera sejam substituídos por máquinas que permitem a interação com o público. Eles são enviados ao Instituto Smithsonian, em Washington, o maior complexo de museus do mundo. Um dia Larry recebe um telefonema desesperado de Jedediah (Owen Wilson), o caubói diminuto, pedindo sua ajuda. Larry invade o Smithsonian e descobre que o faraó Kahmunrah (Hank Azaria) despertou, tornando-se uma ameaça não apenas para seus amigos como para o planeta.

Um segurança sonhador aceita trabalhar no turno da madrugada no Museu de História Natural de Nova York. Durante seu trabalho, porém, coisas estranhas começam a acontecer – maias, gladiadores romanos e cowboys saem de suas maquetes e travam batalhas épicas; em sua busca por fogo, um neandertal queima sua vitrine; Átila – O Huno começa a pilhar a sua ala do museu e um Tiranossauro lembra a todos os motivos pelos quais ele é considerado o maior predador de todos os tempos. Em meio ao caos, a única pessoa que pode ajudar o segurança é a figura de cera do presidente Teddy Roosevelt